EGFR受体内化的定量分析和可视化研究

我们通过CRISPR敲入技术构建了内源性HiBiT标记的EGFR细胞。在内源基因位点进行标记可确保蛋白质在天然调控下以内源水平表达，这对准确研究受体信号传导和运输等生物学相关过程至关重要。我们选择在天然信号肽与成熟EGFR蛋白N端（第24/25位残基）之间设置敲入位点，以在信号肽被切除后维持正确的运输路径和HiBiT完整性。当天然信号肽未知或未定义时（约80%的GPCRs属于此类情况），可将经过充分表征的替代信号肽（如IL-6）与HiBiT共同引入。但需确保仅存在单一信号肽以保证蛋白质正确运输。

当HiBiT呈现于细胞外时，使用抗HiBiT单克隆抗体XFD偶联物进行活细胞流式细胞术可实现HiBiT阳性细胞的CRISPR编辑细胞池富集。本实验中，流式结果显示细胞池含有约10%的HiBiT-EGFR细胞（图1，红色迹线）。随后通过测序和等位基因计数验证基因编辑过程中未发生额外突变，建立了单克隆HiBiT-EGFR细胞系。后续流式检测证实该克隆细胞系表面HiBiT-EGFR表达稳健（图1，橙色迹线），验证了HiBiT标记未破坏EGFR向质膜的运输过程。

内化作用是调控EGFR信号传导与降解的关键机制。配体结合后，EGFR经历内吞作用，随后被回收或通过溶酶体降解，这些过程精确控制信号传导的强度与持续时间。EGFR内化作用受阻会导致信号传导延长，从而引发癌症中常见的细胞生长与存活失控现象（1, 2）。

Nano-Glo® HiBiT细胞外检测系统通过将底物和纯化的细胞不可渗透LgBiT直接加入活细胞培养基，可检测HiBiT标记的EGFR表面表达水平（图2）。LgBiT选择性结合细胞外HiBiT，产生仅针对质膜定位EGFR的特异性发光信号。内化作用会将HiBiT-EGFR从细胞外环境移除，导致发光强度与内化量成比例下降。Nano-Glo^® HiBiT细胞外检测系统支持微孔板式快速定量检测，也可通过GloMax^® Galaxy细胞成像仪进行成像分析（仅限研究使用）。

图2. Nano-Glo^® HiBiT细胞外检测原理。将纯化的LgBiT（一种对HiBiT具有高亲和力的NanoBiT^®萤光素酶片段）加入活细胞培养基后，可选择性定量细胞外HiBiT，因为LgBiT无法穿透细胞膜。 

通过GloMax® Galaxy细胞成像仪进行活细胞生物发光成像进一步验证了上述结果。将HiBiT-EGFR克隆细胞与Nano-Glo^® HiBiT细胞外检测试剂共同孵育，使细胞表面形成活性NanoBiT^®萤光素酶复合物。通过预先形成NanoBiT^®萤光素酶复合物，可利用内体低pH环境中发光强度因pH依赖性降低的特性，动态观察并定量内化过程。将结合LgBiT的HiBiT-EGFR细胞分为未处理组和300 ng/mL EGF刺激组以诱导内化作用，并连续成像30分钟。对照组细胞维持强烈的膜定位与发光信号，而EGF处理组随时间推移显示出渐进性内化，表现为表面发光减弱并伴随内体定位特征性的胞内点状发光信号（图4）。

图4. HiBiT-EGFR内化过程的生物发光成像。

A) HiBiT-EGFR对照组细胞显示稳定的膜定位和生物发光信号（左图），而EGF处理会诱导内化并导致生物发光信号减弱（右图）。图像采集使用GloMax^® Galaxy系统，使用Stagetop恒温控制器配件，进行30分钟连续曝光，单次曝光2分钟。发光信号采用伪蓝色着色。

B) 通过测量图像时间序列的原始灰度值（积分密度）对发光信号的相对光密度（ROD）进行定量分析。

C) 从12分钟时间点选取的光学放大图像，突出显示对照组细胞的膜定位（左图）与EGF处理细胞的胞内点状信号（右图）。

1. Roepstorff K, et al. "Endocytic downregulation of ErbB receptors: mechanisms and relevance in cancer." Histochemistry and Cell Biology. 2008;129(5):563-578.

2. Sigismund S, et al. "Emerging functions of the EGFR in cancer." Molecular Oncology. 2018;12(1):3-20.

3. Sorkin A, Goh LK. "Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs." Experimental Cell Research. 2009;315(4):683-696.

4. Fortian A, Sorkin A. "Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of EGFR endocytosis." Journal of Cell Science. 2010;123(Pt 19):3213-3221.