新型活细胞成像技术 | 让GPCR-配体结合“看得见”

放射性配体结合检测虽灵敏度高但存在显著缺陷：需专业放射性物质处理设施、产生有害废弃物、且依赖膜制备而非完整细胞。这意味着他们无法在天然细胞环境中捕捉活细胞动态或受体相互作用。该技术亦不适用于动力学检测和高通量筛选，尤其对具有快速结合动力学的肽类配体。

为突破这些限制，Zhu团队采用基于HiBiT的NanoBRET^®配体结合检测研究活细胞中甘丙肽受体1（GALR1）的相互作用。HiBiT是一种11氨基酸肽段，当与源自NanoLuc^®萤光素酶的大亚基LgBiT结合时，可产生强生物发光信号（点击了解HiBiT技术详情）。该互补系统配合Nano-Glo^®底物能在细胞表面生成发光供体信号。当荧光标记的甘丙肽结合受体时，通过生物发光共振能量转移（BRET）将能量传递至受体染料，实时生成反映受体占位的信号。这种基于细胞的检测无需膜制备、放射性物质或洗涤步骤，即可在天然环境中实现灵敏的非放射性配体结合检测。

为适配GALR1研究，作者合成了六种BODIPY标记的肽示踪剂。这种光稳定的小分子荧光团特别适合NanoBRET^®检测等能量转移应用。研究中通过长短不同的连接体将染料与截短甘丙肽偶联，以探索距离和几何结构对BRET信号的影响。

六种示踪剂采用不同肽骨架设计：Gal(1-15)、M40和全长甘丙肽。每种均在特定位点进行BODIPY修饰。通过饱和结合与竞争置换实验评估其特异性、结合亲和力及动力学特性。所有示踪剂均能在活细胞中结合GALR1，肽段长度与连接体设计的差异会影响BRET信号强度与受体结合。

值得注意的是，研究者发现示踪剂与受体的结合强度（结合亲和力）与其激活受体的能力高度匹配。具体而言，与GALR1结合更有效的肽示踪剂能更强力地招募β-抑制蛋白（GPCR信号传导关键蛋白），并引发更显著的受体从细胞表面内化。这表明NanoBRET^®检测不仅能识别结合事件，还可预测下游受体活性。研究团队通过三种方法验证了该关联性：NanoBRET^®检测用于监测结合状态，β-抑制蛋白募集实验测定信号传导激活，基于HiBiT的受体内化检测追踪受体运输轨迹。

为确认示踪剂对GALR1的特异性结合及其可逆性，研究者采用生物发光成像技术。通过GloMax^® Galaxy细胞成像仪，在表达HiBiT标记GALR1的细胞系中观测到NanoBRET^®信号。当荧光示踪剂结合受体时，从发光供体（HiBiT/LgBiT）到BODIPY标记示踪剂的能量转移在受体通道产生清晰可辨的信号。加入过量未标记甘丙肽后信号减弱，证实了结合的特异性与竞争性置换能力。

这种可逆性对模拟真实药理学的配体结合检测（如竞争置换筛选或动力学研究）尤为重要。它确保NanoBRET^®信号不仅具有靶标特异性，还能响应生物学相关变化（如竞争配体的存在）。这为未来药物筛选提供了实用方案，候选化合物对示踪剂的置换可实时反映活细胞中的受体结合情况。

该配体结合检测结合GloMax^® Galaxy细胞成像仪获取的图像，无需蛋白过表达或细胞固定即可实现高分辨率观测。与传统荧光显微镜不同，该方法采用天然受体表达和活细胞兼容检测试剂，能更清晰、更生理相关地展示受体-配体相互作用。简化的操作流程（无需洗涤和透化步骤）使其特别适合结合事件的实时定性成像与定量分析。

1. Zhu, H. et. al. “Development of a HiBiT Peptide-Based NanoBRET Ligand Binding Assay for Galanin Receptor 1 in Live Cells.” ACS Chem. Biol. 2025, 20, 1594–1608.