使用均相生物发光检测法监测cGAMP的生成与降解

技术原理

监测cGAMP浓度的cGAMP发光检测法示意图

检测特异性和灵敏度

图A. 该测定方法对cGAMP具有高度选择性，在所有测试的环状核苷酸中，仅3',3'-cGAMP产生了微弱响应，但其效力较2',3'-cGAMP的检测灵敏度低100倍（EC50分别为586 nM与4.89 nM）。

图B.进一步证实cGAS的激活需要双链DNA的参与——在添加单链DNA或无DNA的对照实验中均未观察到响应，这证明双链DNA是该酶激活的必要条件。

生化cGAS与ENPP1活性及抑制剂研究

在生化反应中使用Lumit® cGAMP 技术评估cGAS抑制剂的效果。为验证本检测方法在抑制剂筛选中的应用价值，我们选用两种已知cGAS抑制剂（RU-521与CU-32）进行测试。实验采用两个cGAS浓度梯度（5 ng与20 ng），结果显示：随着酶浓度升高，两种抑制剂的IC50值均相应增加。数据表明RU-521的抑制效果显著优于CU-32——10 μM浓度的RU-521即可实现cGAS的强效抑制，而70 μM的CU-32仅使酶活性降低30%。本研究证实该检测方法适用于cGAS活性调节剂的高通量筛选，为开发具有临床潜力的抑制剂提供了可靠平台（图C,D）。

图E. 我们在此证明，Lumit® cGAMP 免疫检测法是筛选ENPP1抑制剂的理想方案。如图所示，在使用低至10 nM cGAMP作为底物的条件下，该检测方法对高达30 ng的ENPP1浓度梯度均呈现线性响应。

图F.在我们使用ENPP1抑制剂C进行的抑制研究中，IC50值分别为108 nM（仅含锌缓冲液）和110.9 nM（含钙/锌缓冲液）。无论是否存在钙离子，IC50值均基本一致，这表明CaCl₂对抑制剂效能影响甚微。

监测不同细胞系中多种dsDNA诱导的cGAMP水平

THP-1, THP-1 Dual, and THP-1 Dual KO cGAS using Reporter Assay

我们进一步验证了该检测方法的双重应用价值：既可定量cGAMP产量，又能评估cGAMP通过STING通路激活干扰素反应元件对报告基因活性的影响。为此，我们采用THP-1、THP1 Dual™及THP1-Dual™ KO-cGAS细胞系，在双链DNA刺激下监测细胞干扰素应答。THP1-Dual™细胞系通过稳定整合两种诱导型报告基因构建体，可同步监测NF-κB通路（通过SEAP活性）与IRF通路（通过Lucia萤光素酶活性）。

实验显示：用8 μg/ml VACV-70和ISD dsDNA处理48小时后，10万/孔细胞分别产生31倍和35倍以上的应答增强，而cGAS基因敲除细胞（THP1-Dual™ KO-cGAS）始终无应答，证实cGAS是该通路激活的必要条件。使用VACV-70与ISD dsDNA处理24小时即观察到干扰素应答增强，且当细胞数增至10万/孔时干扰素产量达到峰值。通过测试不同细胞数量与dsDNA孵育时间，我们发现在各细胞数量组中干扰素水平均呈现数倍提升（图B和C），但KO-cGAS细胞在VACV-70或ISD双链DNA刺激下始终未诱发干扰素应答。